华南地区双螺旋生物仪器数字PCR荧光通道

数字PCR技术流分类目前，dPCR的基本方法都已经建立，根据反应单元的不同形式，主要可分为微板式、微腔式和和微滴式三大类系统。微液滴制备的方法，目前主流的有四种：1）芯片微孔物理分割法，俗称物理分隔法，公司有Fluidgm，Qiagen，Roche，ThermoFisher，;2）液滴分割法，俗称油包水，代替公司有Bio-Rad;3）杂交式芯片液滴法，公司有Stilla;4）注射振动制滴法。PS：芯片式物理分割技术所有已经过期，目前有不少公司在这个技术的基础上进行开发，例如罗氏。数字PCR技术min检测下限可到2copies/ml，比qPCR灵敏度提升了100倍。华南地区双螺旋生物仪器数字PCR荧光通道

数字PCR技术是继一代普通PCR、二代荧光定量PCR之后的第三代PCR技术。该技术将一个样本分成几到几十万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增；扩增结束后，将有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。定量：不再依赖于Ct值和标准曲线，直接给出靶序列的起始浓度，实现真正意义上的定量。更高灵敏度与特异性：数字PCR可实现万分之一稀有样本的定量，可用于极微量核酸样本检测、复杂背景下的稀有突变检测、表达量微小差异鉴定、单细胞基因表达等方面。数字PCR在分子诊断领域将会发挥巨大的作用，数字PCR适用于生物标志物研究、拷贝数变异分析、微生物检测、转基因生物检测、mRNA和miRNA检测、基因相对表达研究等，并对遗传病、、产前诊断的研究提供了一种全新的技术思路与手段，具有广的、不可替代的应用前景。华南地区双螺旋生物仪器数字PCR荧光通道数字PCR的应用甚广，除了可应用于进行突变的检测以外，也可运用于基因扩增的检测。

微滴数字PCR主要是将两种互不相溶的液体，以其中一种作为连续相（油），另一种作为分散相（水），在水/油两相表面张力和剪切共同作用下分散相以微小体积单元的形式存在于连续中，从而成液滴。这种液滴式的反应腔室具有体积小、样品间无扩散等优势。在ddPCR中，利用微滴发生器可以一次生成数万乃至百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴，作为数字PCR的样品分散载体。这里，液滴中包裹了单拷贝DNA模板和PCR反应液，然后将液滴收集在PCR反应管中进行扩增。PCR反应结束后检测每个微滴的荧光信号。目前Bio-Rad公司的QX100系统、QX200系统均为采用液滴技术的数字PCR系统。图6.Bio-Rad的液滴数字PCR系统

无创产前筛查有望成为数字PCR在临床快速落地的锏应用。首先，无创产前筛查领域对于兼顾成本、准确性、速度的创新技术的需求还未满足。其次，无创产前筛查市场空间庞大，虽说中国每年新生儿的增长速度正在放缓，但每年仍有超过1000万的新生儿，带来了巨大的想象空间。2022年6月，郑大一附院遗传与产前诊断中心、塔歌生物联合在JournalofTranslationalMedicine（影响因子5.531）杂志上发表文章，验证了数字PCR作为T21,T18和T13产前筛查方法的可行性，这是世界上报道在真实临床条件下通过盲检实现一管反应可从孕妇血浆样本中同时检测出T21、T18和T13的数字PCR无创产前筛查试剂盒。文章显示，塔歌生物胎儿染色体非整倍体无创产前筛查数字PCR试剂盒总体筛查的灵敏度为100%，特异性为95.12%，均优于血清学筛查。除准确率高之外，塔歌生物的产品还拥有成本低、操作简便，及检测速度快等优势，可以加速无创产前筛查在各级医院，特别是基层地区普遍落地，助力中国出生缺陷防控。在dPCR中，样品被分区，使得样品内单个的核酸分子被定位并被集中在许多分离的区域内。

产物越短，往往扩增效率越高。模板二级结构（Templatesecondarystructure）：PCR变性中和变性后的单链DNA不够稳定，容易自发折叠形成二级结构。应避免可形成稳定二级结构的模板链区域，因为如果模板链形成的二级结构在退火温度下稳定存在，定位在模板链二级结构处的引物将无法同模板链相结合。使用mfold可预测引物待结合的区域是否存在复杂的二级结构。设计引物时，尽量使引物定位在模板二级结构以外的序列上。避免具有4个以上相同的连续碱基的区域（Avoid>4repeatsofsamebases）：以避免延伸阶段聚合酶“滑动（PolymeraseSlippage）”。选择GC含量（GCContent）在50-60%之间的区域。如果高GC含量区域不可避免，可以尝试提高退火温度，并使用添加剂，例如甘油，dPCR可直接溯源SI国际单位制摩尔，适合单一、双重及多重转基因标准物质研究，一次可识别不同的转基因区域。法国国产数字PCR性能特点

拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。华南地区双螺旋生物仪器数字PCR荧光通道

在精细诊疗领域，患者外周血中的循环DNA（ctDNA），在的早期筛查，围术期监测，药物疗效评估，预后等方面具有重要的临床应用价值。在肺液体活检领域，EGFR突变由于其在东亚人群中的高突变率,实现精细检测显得尤为重要。研究表明，相较于荧光定量PCR，数字PCR对于血液ctDNA的检测灵敏度更高（0.01%），EGFR突变的阳性检出率也更高。在患者术后复发检测中，数字PCR评估出的ctDNA阳性，可以早于影像学数月提前揭示出患者复发。因此，该项技术在肺精细诊疗中具有重要的作用。华南地区双螺旋生物仪器数字PCR荧光通道

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