上海赛默飞数字PCR样品回收

时间:2023年06月16日 来源:

dPCR的结果统计方式有2种,一种是采用标记多种颜色,通过不同检测通道分辨不同颜色和强度,再根据分散液滴的数量计算待测基因的含量;另一种采用概率统计的数据处理方法,即通过泊松分布的方法对结果进行分析。应用概率统计分析数据和对数据处理方法的模型直接关系着结果的准确性和分析时间的长短。常用的统计方法是假设每个微反应单元的体积相同,根据泊松统计计算拷贝数,公式为:M=-Vx1n(1-x/)其中M是目标总拷贝数量;V是微反应单元数量;x是发光的微反应单元数量。数字PCR在检测珍贵样品和样品核酸存在降解时具有明显的优势。上海赛默飞数字PCR样品回收

相比于qPCR,dPCR在转基因检测中具有以下优势:(1)检测灵敏度高:理论上dPCR的灵敏度可达1个拷贝,而实际应用中dPCR的小检出限和比较低定量限数值非常接近,所以dPCR可以在非常低的目标拷贝数下得到精确的结果;通常转基因比参考基因(内源基因)浓度低很多;(2)前处理简单且受基质成分干扰较小:dPCR反应效率和精密度受到食品基质成分干扰影响较小,可应用于混合基质样品中低丰度DNA的检测;(3)dPCR对抑制剂的敏感性较低:由于dPCR结果表示为“有荧光“或“无荧光”,即使存在抑制剂降低了荧光强度仍可以表示为“有荧光;(4)适合多重转基因检测:食品或饲料提取的DNA中可能包含多种转基因片段,可以进行多重dPCR检测,提高分析效率。同时,dPCR可以直接溯源至SI国际单位制摩尔,适合单一、双重及多重转基因标准物质研究,一次可识别不同的转基因区域。下面详细进行说明。上海数字PCR分析应用数字PCR等新兴技术要在临床应用上得到爆发式增长,有赖于LDT市场的放开。

数字PCR产品的发展,为不同场景下的多样化核酸检测需求提供了新的思路,尤其是在医学检验方面,在 性疾病早期检测、病症的液体活检、无创产前检查等领域展现出良好的应用前景。实现 性疾病早期高效检测——以病毒为例,有病毒检测、和临床样本病毒载量评估He监测环境病毒载量二代荧光定量PCR检测技术是目前病毒检测的"金标准",但由于病毒探针结合位点突变、样本病毒载量不足等原因,在临床检测过程中经常出现假阴性结果,由于数字PCR具有更高的灵敏度、精细度,以及其适合痕量样本检测的特性,能够检测出荧光定量PCR检测过程中错过的 ,可作为后者的补充。在人群筛查及临床诊疗中,为科学选取采样方式,需要评估不同临床样本病毒载量,如鼻咽拭子、血尿、粪便、肺泡灌洗液等,由于数字PCR可提供一定程度上量化指标,为采样方法的选取提供了参考,从而提高检出率。在外防输入的战略要求下,环境病毒检测工作尤为重要,数字PCR可对低核酸丰度样本进行有效检测,包括从不同环境中取样的样本,如病房、医院卫生间、实验室等等,在病情防控中起到了不可忽视的作用。此外,数字PCR的应用场景还有病程不同阶段的病毒载量评估、核酸参考品制备、抗病毒药物研发等环节。

20世纪末,Vogelstein等提出数字PCR(digitalPCR,dPCR)的概念,通过将一个样本分成几十到几万份,分配到不同的反应单元,每个单元至少包含一个拷贝的目标分子(DNA模板),在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促合成反应,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。dPCR仪器在操作中集成了前处理以减少手工移液和样品转移的操作,增加了通量,并在价格上具有优势。

ThermoFisherQuantStudio3D是另一个经典的芯片式数字PCR平台,其基本的检测流程是:将反应液加入到涂布器中,通过涂布器将反应液均匀涂布在有20000个微孔的芯片上,将芯片放在PCR仪上扩增,将芯片放入读取仪中采取拍照的方式读取荧光信号。操作较为复杂,整个过程在封闭的芯片中进行,污染的风险较低。STILLANaica是一个较新的数字PCR平台,基本的检测流程是:将反应液加入芯片,将芯片放入微滴生成扩增系统,生成30,000个微滴单层平铺于芯片中,PCR扩增在芯片上完成。然后将扩增后的芯片转移至微滴阅读分析系统,采取拍照的方式读取荧光信号。由于整个过程在封闭的芯片中进行,污染的风险较低。相同模板进行 96 次扩增,终点处产物量不恒定,但 Ct 值却极具重现性。上海数字PCR分析应用

臻准推出新款数字PCR产品:AccuONE2.0数字PCR系统。上海赛默飞数字PCR样品回收

引物设计(DesignPrimers):引物长度(PrimerLength):18-25个碱基之间。短的引物更易于同靶序列结合,但过短的引物也更可能同基因组上的多个区域相结合而产生非特异性扩增产物。更长的引物会提高同靶序列结合的特异性,但过长的引物(>30bp)同靶序列结合速度变慢,降低结合率。引物长度和组成直接影响引物Tm值(PrimerMeltingTemperature)和退火温度(AnnealingTemperatures)。引物的组成——GC%含量(GCContent):指引物总碱基中G和C碱基数量的百分比,该值应在40-60%之间。如果模板序列的GC含量较高,推荐使用较高Tm值的引物。上海赛默飞数字PCR样品回收

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