苏州一体化数字PCR技术

基于微滴的QX100dPCR仪，利用油包水技术，将样品平均分配到20000个微滴油包水中，利用微滴分析仪对微滴进行分析。2012年RainDance公司推出了RainDropdPCR仪，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成包含100万至1000万个皮升级别微滴的反应乳液。数字PCR就形成了2大派别，芯片式和微滴式。不论是哪种数字PCR，其原理都是有限稀释，终点PCR和泊松分布。将含有核酸模板的标准PCR反应体系，平均分配成几万个PCR反应，分配到芯片或微滴中，使每个反应中尽可能含有一个模板分子，进行单分子模板PCR反应，通过读取荧光信号的有或无进行计数，经过统计学泊松分布的校准进行定量。使用数字PCR技术对436例非小细胞肺*样品进行检测，并挑选样本验证一致性。苏州一体化数字PCR技术

PCR已成为分子诊断领域重要的技术手段之一，占据分子诊断市场的半壁江山。数字PCR是一代PCR技术，也是当前灵敏度和定量精度比较高的分子检测技术。但数字PCR使用成本仍然相对较高，检测靶点数少（一般≤6靶点/反应），阻碍了其在临床中的大规模应用，提高数字PCR的多重检测能力迫在眉睫。基于荧光通道数的增加和基于探针浓度梯度增加，均可以在一定程度上提高数字PCR检测重数，然而只能达到"线性"增加的目的。基于探针浓度梯度的多重检测技术虽然光'f明显增加多重能力，但由于无法避免交叉反应现象，不能确保获得位点特异性的分簇，因此稳定性不足、灵敏度较差，难以满足临床级别的数据要求。而基于创新的且数字PCR独特适用的荧光编码技术可以实现“指数”级的多重检测，颠覆性的提高数字PCR检测重数，覆盖临床应用多场景需求。法国全自动数字PCR价格dPCR被称作第三代PCR技术，但dPCR技术的广泛应用逐渐显现出一些不足之处。

根据泊松分布的定义和适用条件可知，如果我们设微液滴总数为N，投入的靶序列拷贝数为M，那么“每个微液滴中的靶序列拷贝数”的概率分布是近似满足泊松分布的。理解之前，首先要明确一点，在检测的过程中，并不是说一个样本中检测到了几个亮点，这个反应当中就有几个目标基因的拷贝。因为目标基因的片段，在微滴当中的分布，是符合泊松分布的（也就是说进不进的概率相等，并且相互独立）。所以，一个发光的微滴中，可能有一个或者三个四个，甚至更多个目标基因的拷贝。因此，发光的微滴数与原始的基因拷贝数并不是一对一的对应关系。

作为时下的热点技术，数字PCR是将核酸样品分配到大量单独、平行的微反应单元（nL，纳升级别）中，使得每个反应单元中尽可能含有1个模板分子，并在此基础上进行扩增、检测和分布统计，从而实现靶标分子的比较 计数。（图：数字PCR技术原理）根据微反应单元的不同形式，数字PCR产品可分为微板式、微滴式和芯片式等。目前，市场上主要的数字PCR产品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系统和ThermoFisher公司的QuantStudio系统等。与一、二代PCR技术相比，数字PCR具有很多优势：一是特异性、灵敏性均有显著提高；二是在不依赖内参和标准曲线的前提下，可直接得到比较 量化指标；三是微反应单元相互独立、封闭，避免了PCR抑制剂及不同核酸分子扩增产物间的相互干扰，准确度和可重复性较高。数字PCR具有诸多优点，但也存在一定的不足，如成本高、仪器操作复杂、经济效益低等。

目前dPCR主要有两种形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。可以使用几种不同的方法来分配样品，包括微孔板，毛细管，油乳剂和带有核酸结合表面的小型化腔室阵列。样品的分配使人们可以通过假设分子种群遵循泊松分布来估计不同分子的数量，根据泊松分布的原理，反应体系中目标分子的拷贝数可以通过公式A=-ln[(N-X)/N]*N计算，从而解决了多个目标分子存在于单个液滴中的可能性。相同模板进行 96 次扩增，终点处产物量不恒定，但 Ct 值却极具重现性。苏州医疗系统认证数字PCR市场前景

dPCR在转基因检测方面的应用仍处于研究和探索的阶段。苏州一体化数字PCR技术

dPCR在使用过程中需要特别注意体积误差造成的结果偏差。体积误差对于测量拷贝数浓度会产生偏差。目前dPCR中体积优化方法以光学显微镜观测为主。分散体积的差异会增加拷贝数结果的不确定性，Emslie等使用光学显微镜纵向拍照比较图片边缘的微小差异，考察了数字PCR系统中每个微孔内和孔与孔间的体积差异对实验结果的影响程度。Corbisier等使用微滴数字PCR对6种不同质量分数棉籽粉质粒DNA标准物质[ERM-AD623a-f，浓度范围（10~10）copies/ul]进行分析，优化了液滴体积得到相应校正因子，并使用该校正因子发现并校准了运行软件中液滴体积不变的假设而引起的数据偏离，数据结果的一致性有明显提高。苏州一体化数字PCR技术

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