Tris-MOPS-SDS电泳缓冲液(10×

加药时间:由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。培养液:加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞。这时会出现两个问题：1.死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。2.孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。科研实验中试剂取用应注意事项：视线与量筒内液体的凹液面的低处保持水平。Tris-MOPS-SDS电泳缓冲液(10×,pH8.3)

PAGE连续蛋白上样缓冲液，科研专门***科研实验中试剂取用应注意事项：1. 固体试剂的取用:取用固体药品时药匙必须是干净的.一支药匙不能同时取用两种或两种以上的试剂.药匙每取完一种试剂后都必须用干净的纸擦拭干净,以备下次使用.药匙的两端为大小两匙,取固体量较多时用大匙,较少时用小匙2. 取用不定量(较多)液体——直接倾倒a. 瓶塞必须倒放在桌面上【防止药品腐蚀实验台或污染药品】；b. 直接倾倒时瓶口必须紧挨试管口，试管45度，并且缓缓地倒【防止药液损失】；c. 贴标签的一面必须朝向手心处【防止药液洒出腐蚀标签】。大肠杆菌基因组DNA提取试剂盒(CTAB沉淀法)杀灭曲线的建立：按照20-25%的细胞密度将未转化的细胞铺在合适的培养板上。

杀灭曲线的建立：通过建立杀灭曲线（剂量反应曲线），确定能够杀死未转染宿主细胞的较低浓度，从而筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株。建立杀灭曲线至少选择5个浓度。1、按照20-25%的细胞密度将未转化的细胞铺在合适的培养板上，37℃，CO2过夜培养（需要更高密度，可增加接种量）。2、根据细胞类型，设定合适的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例，可设定50，100，250，500，750，1000μg/mL。3、第2天换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基，每个浓度做三个平行孔。4、接下来每3-4天更换新的含药物培养基。5、按照每2天进行活细胞计数，来确定杀灭未转染细胞的恰当浓度。通常7-10天内能够杀死绝大多数细胞的较低浓度为筛选用的工作浓度。

弱酸-弱碱型缓冲溶液的构成与配制。这类缓冲溶液的组成为：弱酸+弱酸盐（即共轭碱）、弱碱+弱碱盐（即共轭酸）。常见的实例有：HAc-NaAc、HAc-NH4Ac（微酸性）、NH4Cl-NH3.这类缓冲溶液的实验室配制方法一般是根据溶液组成和浓度要求，直接称取或量取弱酸、弱酸盐溶液或弱碱、弱碱盐溶液来配制。其实，这类缓冲溶液还可以用强酸与弱碱、强碱与酸来配制，归纳起来，应该有三种配制方法：（1）弱酸+弱酸盐，弱碱+弱碱盐例如，HAc-NaAc、NH4Cl-NH3（2）弱酸（过量）+强碱（适量），弱碱（过量）+强酸（适量）例如，HAc（过量）-NaOH（适量）、NH3（过量）-HCl（适量）。这类缓冲溶液需要的共轭碱（NaAc）或共轭酸（NH4Cl）是通过反应后产生的。（3）弱酸盐（过量）+强酸（不足量）或弱碱盐（过量）+强碱（不足量）例如，NaAc（过量）+HCl（适量），NH4Cl（过量）+NaOH（适量）缓冲溶液需要的弱酸（HAc）或弱碱（NH3）则通过反应后产生。BMC原代分离步骤：加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500rpm，10min。

淋巴细胞分离液：淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂。常用的淋巴细胞分离液有Ficoll淋巴细胞分离液、Percoll淋巴细胞分离液。Ficoll与Percoll分离单个核细胞的方法均为密度梯度离心法。分离原理：外周血中单个核细胞和单核细胞,其体积、形态和密度与其他细胞不同，淋巴细胞分离液是一种密度介于1.075~1.090之间而近似于等渗的溶液,用它做密度梯度离心,使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。淋巴细胞分离液Lymphocyte Separation Medium（human, Ficoll-Paque ）是世界范围内用于体外研究分离人淋巴细胞的实验室公认的标准。氨苄青霉素溶液配置：加入40ml灭菌水，充分混合溶解之后定容至50ml。大肠杆菌基因组DNA提取试剂盒(CTAB沉淀法)

BMC原代分离步骤：吸取稀释血液，在离分层液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入。Tris-MOPS-SDS电泳缓冲液(10×,pH8.3)

淋巴细胞亚群及其功能：T淋巴细胞及其分类主要应用抗T细胞表面抗原McAb.根据T淋巴细胞表面分化抗原将成熟T细胞分为CD4+、CD8-和CD4-、CD8+两大亚群，T淋巴细胞的功能与表现型之间的对应关系是相对的，其免疫活性可能受“微环境”的影响，并受MHC抗原的制约，许多研究证明，CD4+T细胞具有杀伤活性，介导Ι类抗原不相容时的靶细胞溶解。TU等研究表明，CD4+的细胞毒活性存在两种完全不同的机理，并证明TH1和TH2的细胞毒活性不同。前者强，后者弱或无活性。Dennert等发现，克隆化的T淋巴细胞具有辅助，细胞毒活性和迟发型超敏反应作用，这种功能的多样性有赖于所采用的分析方法。CD4+细胞识别Ι类MHC抗原，其效应的发挥也受Ι类抗原的制约；CD3+细胞识别Ι类MHC抗原，发挥免疫效应也受其控制。Tris-MOPS-SDS电泳缓冲液(10×,pH8.3)