安徽FabRICATORIdeS蛋白酶IgG特异性蛋白酶

与IdeS不同，Romiplostim 由四个相同的血小板生成素 （TPO） 受体结合肽和一个 Fc 片段组成，通过柔性聚甘氨酸序列连接在一起。与度拉糖肽类似，用 Genovis的GlySERIAS Immobilized 在 37°C 下过夜，或用 GlySERIAS 冻干 1 小时并在 37°C 下过夜消化该蛋白质。 链间二硫键被还原，以便于通过反相LC-MS进行以下分析。与度拉糖肽的观察结果类似，用固定化酶消化产生均质的 Fc/2，剩下一个连接子残基，此处为甘氨酸残基。这有助于识别专门位于Fc区域的修改。用冻干酶消化 1 小时得到 Fc/2，剩余 4 个甘氨酸残基和少量的 Fc/2 仍与一个 TPO 肽连接。另一方面，这使得研究 Fc/2 和第yi个肽之间的连接区域成为可能，而不会受到第二个肽的干扰。用 GlySERIAS 冻干液过夜消化产生 2 个 Fc/2 变体，分别剩下 4 个和 1 个甘氨酸残基。根据消化时间的不同，使用冻干产物释放的肽以五或七种变体存在，接头中残留的甘氨酸残基数量不同，而使用固定化产物释放的肽以四种变体存在。用于表征zhiliao用途的单克隆抗体、Fc融合蛋白、ADC和生物仿制药。安徽FabRICATORIdeS蛋白酶IgG特异性蛋白酶

与肽图谱相比，根据Genovis科学家的经验，尤其是对于像抗体这样的分子，许多人在常规实验中做了太多的肽图谱，而中级水平（Middle-level）的方法可以很好地工作。中级方法（IdeS酶切抗体）需要更少的实际操作步骤和较少的示例处理，所有这些都意味着过程中出错的事情更少。我们的许多酶可以作为平台方法，同样的方法适用于绝大多数的抗体，这不是肽图的情况下，可能需要优化整个样品制备，LC分离，质谱设置和数据分析的每个不同的抗体分析。这些变化可能是很小的，但没有一种适用于所有肽图的方法。由于分析和数据分析的简单性，中级方法非常适合自动化和高通量的工作流程。肽图当然可以自动用于样品制备，但高通量肽图生成大量数据，仍然需要彻底分析。事实上，肽图谱是一个多步骤的过程，每一个步骤都可能破坏方法，并可能导致破坏蛋白质的人工制品，很难交叉训练给非专业人员。中级水平的方法很容易交叉训练，我们的方法在质量控制实验室中被成功地使用。肽图谱是一种用于修饰分析和氨基酸确认的方法，但一旦完成了这一工作，我相信使用中级分析可以成功地更有效地完成抗体样本的大部分工作。山东FabALACTICAIdeS蛋白酶IgG特异性蛋白酶为了降低度拉糖肽复杂性，使用GlycINATOR Lyophilized去除Fc聚糖，并用DTT还原链间二硫键。

与IdeS不同，Genovis的GingisREX（RgpB）是一种精氨酸特异性蛋白酶，可消化精氨酸残基的C末端蛋白质，包括难以与其他酶消化的Arg-Pro键。该酶可用于肽图分析、从头肽测序和翻译后修饰分析。精氨酸残基的特异性C-末端消化；在其他困难的精氨酸-脯氨酸序列中可靠消化；产生更长的肽-提高序列覆盖率。GingisREX是一种半胱氨酸蛋白酶，可特异性地消化肽键C末端到精氨酸残基，包括与脯氨酸相连的精氨酸。半胱氨酸是酶活性所必需的。与胰蛋白酶消化相比，可生成更长的肽，胰蛋白酶消化可以通过高分辨率质谱进行分离和鉴定。这为自下而上方法的样品制备提供了更多选择，以实现替代的酶解曲线和更高的序列覆盖率。GingisREX在赖氨酸上没有活性，通常使用Arg-C观察到。该酶在5.0-9.0的宽pH值范围内具有活性，它需要半胱氨酸并被盐酸胍抑制。该酶是从牙龈卟啉单胞菌中纯化的。

对于涉及完整Fab或Fc抗体片段的应用，需要在抗体铰链处进行消化。木瓜蛋白酶和 Lys-C 等传统酶可用于生成 Fab 片段，但非特异性酶活性需要仔细优化，以极大限度地降低多个消化位点的风险。Genovis的SmartEnzymes IgG 蛋白酶 GingisKHAN 和 FabALACTICA 具有一个消化位点，可从人 IgG1 生成均质的 Fab 和 Fc 抗体片段。生成的片段可用于结晶和高阶结构 （HOS） 的 NMR 研究、结合研究等。在这里，我们提出了获得完整Fab和Fc抗体片段的不同策略。所得片段显示 GingisKHAN 的有效消化，用于生成完整的 Fab 片段或从依那西普上的融合 TNFR 结构域中分离 Fc。由于 GingisKHAN 的特异性消化依赖于 IgG 的天然折叠，因此在变性条件下特异性受到负面影响。为了使用SDS-PAGE分析消解效率，在加入SDS上样缓冲液之前，停止在分析样品中加入碘乙酰胺的反应。Genovis同时提供IdeS酶的纯化试剂盒。该酶在pH 值范围为 5.0 至 9.0 时显示出活性。

蛋白酶用于生成肽，用于质谱分析蛋白质。这些应用包括蛋白质组学和生物制药的深度表征。由于遗漏了切割和样品制备诱导的伪影，传统的蛋白酶并不总是理想的，因此需要具有不同特异性的蛋白酶工具箱。Genovis的GingisREX 是一种精氨酸特异性蛋白酶，可将蛋白质 C 末端消化为精氨酸残基。与胰蛋白酶肽相比，所得肽更长，并可能导致序列覆盖率增加。质谱分析中蛋白酶的特异性对于获得高质量的数据集和避免复杂的数据解释至关重要。作为模型底物，使用胰岛素氧化β链来比较 GingisREX 和 ArgC 的酶特异性。胰岛素氧化β链含有一个精氨酸和一个赖氨酸残基。在RP-HPLC和质谱法上分析GingisREX和ArgC的酶切肽。GingisREX在赖氨酸残基上没有酶活性或其他额外活性，即使在长时间孵育过夜后，酶与底物的比例也很高（1：5）。然而，ArgC在精氨酸残基上显示出主要活性，但在赖氨酸残基上也可以看到酶消化。在酶与底物的比例为 1：20 和过夜孵育下，证明了 ArgC 的额外非特异性活性。在相同条件下，GingisREX未检测到这种情况。数据证实了GingisREX精氨酸残基的特异性活性，并显示使用Arg-C在赖氨酸和其他残基处的非特异性消化。在抗体药及核酸药领域，倍笃生物产品线涵盖药物研发的全流程，抗体结构域分析蛋白酶、蛋白聚糖分析水解酶。陕西GlycINATORIdeS蛋白酶抗体酶切

Genovis的GingisREX （RgpB） 是一种精氨酸特异性蛋白酶。安徽FabRICATORIdeS蛋白酶IgG特异性蛋白酶

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