杭州彩色逆转录酶测序

反转录酶的注意事项，随机引物：适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。选择随机引物时，首先链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（<500bp）的增加和长片断、全长产物产物的降低。酵母菌逆转录酶是逆转录酶家族中的一个重要表示，逆转录在研究RNA表达调控等领域有普遍的应用前景。逆转录也可作为RNA表达谱的分析方法。杭州彩色逆转录酶测序

逆转录酶实验流程：从细胞材料中提取RNA→RNA加入到含有逆转录酶、引物、dNTPs的反应体系中→退火，引物与RNA链配对→延伸，逆转录酶合成互补cDNA链变性→常规PCR反应流程（变性、退火、延伸，如此多次循环）。RT-PCR“两步法”与“一步法”RT-PCR的实验操作分为“一步法”与“两步法”两种。一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需构建cDNA文库（即cDNA合成与PCR反应在同一Buffer及酶中进行，一步法完成），省略了cDNA与PCR之间的过程。两步法RT-PCR首先用反转录酶合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR，即RNA反转录与PCR扩增分两步进行。潍坊一步法反转录逆转录是一种将RNA反转录为DNA的生物化学过程。

逆转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。逆转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，由此可构建出cDNA文库（cDNAlibrary），从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中较常用的获得目的基因的方法。简要过程表示：逆转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3'-末端上，按5'→3'方向，合成一条与RNA模板互补的cDNA单链，它与RNA模板形成RNA-cDNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。病毒复制方式：逆转录病毒（属于RNA病毒）：RNA→DNA→RNA。拟逆转录病毒（属于DNA病毒）：DNA→RNA→DNA。

RNA逆转录实验注意事项：RNA定量：除了掌握RNA的完整性之外，反转录之前还需要对RNA浓度进行测定。一般反转录试剂盒会对上样量有要求，建议totalRNA上样量小于5μg。超过这个范围，会使反转录产物产生偏好性(表达丰度高的基因优先被反转录)而造成定量结果不准确。逆转录引物的选择：逆转录引物一般包含3种：oligodT引物，随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可用。逆转录实验过程中避免光照，防止RNA样品和试剂受光降解或刺激。逆转录实验尽量避免多次冻融处理RNA样品，避免样品质量下降。

逆转录酶（M-MLV）从MoloneyMurineLeukemiaVirus分离出来，可用于合成首先链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。本酶是通过点突变使RNaseH活性缺失，所以它具有的DNA聚合酶的活性与野生型相同，同时其延伸能力也有明显提高。逆转录酶（M-MLV）一个活性单位定义为在37℃，10min条件下，使1nmol的脱氧核糖核酸掺入酸性沉淀物质所需的酶量。逆转录酶的三个功能：1、RNA为模板指导的DNA聚合酶活性；2、DNA为模板指导的DNA聚合酶活性；3、RNaseh活性。逆转录实验可以选择加入RNA合成抑制剂RNAse防止RNA降解和污染。潍坊一步法反转录

逆转录实验过程中需要考虑RNA模板质量和RNA纯化的方法。杭州彩色逆转录酶测序

逆转录常见问题及解决方法之RNA浓度不高：a)、原始组织样本或细胞量太少:提高加入量。b)、RNA发生降解:如果使用者确定提取RNA的试剂/器具没有问题，RNA的降解通常发生在样品破碎/匀浆阶段。有两个办法可以彻底抑制内源RNase活性:1.立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。这只适合培养细胞及内源RNase含量较低的并且较容易匀浆的组织，2.对于内源RNase含量高或不易匀浆的组织，如肝脏、胰腺、脾脏、肌肉等，或植物组织，需要切成小块后立即投入液氮冷冻，再按说明进行破碎/匀浆。c)、加入异丙醇后室温沉淀10min或-20C冰沉淀30min即可，无需过夜沉淀。杭州彩色逆转录酶测序