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“做miRNA下调，QPCR检测miRNA，表达水平无变化”如何解决呢？反义核酸是在转录后水平发挥功能，要阻断miRNA的产生，理想情况是在生成成熟的miRNA之前阻断。此要求目前唯有CRISPR / Cas9能实现，Cas9通过在pre-miRNA序列中引入突变，从而破坏miRNA表达，是miRNA基因功能缺失研究的一种新方法。福建肖老师运用Cas9技术，针对miR-21基因设计sgRNA ，通过慢病毒递送细胞，并在RNA水平检测到mir-21的下调表达，从而研究出miR-21耗竭对CNE2鼻咽（NPC）细胞生物学特性及其潜在机制的影响。使用Cas9敲除miR-21之后，功能上也呈现出阳性，此外，温医大医院的张老师使用Cas9敲除mir-545，研究了人环状RNA PRKCI（circPRKCI）通过抑制miR-545显示致性，促进人类神经胶质瘤细胞的病理进展3。所以，CRISPR / Cas9对于miRNA的KO是有效的、被认可的、且以QPCR检测表达量完全没有问题。陕西慢病毒载体第三方检测中心第三方检测QPCR实验就找成都瑞普信！

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“做miRNA下调，QPCR检测miRNA，表达水平无变化”，这到底是怎么回事？现有miRNA抑制手段，无论是基于载体构建的、还是化学合成的，本质上都是用跟成熟体互补的反义miRNA（miRNA海绵体属于不完全互补的反义RNA重复），其可以通过结合miRNA，阻断其与靶基因结合，但并不能有效引发miRNA的降解，原因有两方面：其一是反义RNA与miRNA结合后，序列很短，导致Dicer酶（细胞内降解双链RNA的主角）不能有效结合；其二是miRNA与Ago2以RISC复合物的形式存在，该复合物也会导致Dicer酶无法高效结合。因此，如果以反义RNA技术抑制miRNA功能，QPCR可以做，如果检测出表达水平下降还好，即便未检测到，也不表示抑制无效，正确的做法是直接检测目的基因蛋白水平是否有上调。但若实验者不清楚靶基因的情况下，不检测到miRNA下调，心里是没底的。第三方检测机构哪家比较靠谱？

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    ③待分离胶完全聚合后，倾去其顶部的去离子水，用滤纸将水吸干。④配制4％浓缩胶5mL，加TEMED5μL、10％APS50μL，混匀立即灌胶，灌至顶部，并垂直插入Teflon齿梳，室温静置20min待胶聚合。⑤待胶完全聚合后拔出梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，用电泳缓冲液冲洗上时间就是金钱，效率就是生命唯有惜时才能成功，唯有努力方可成就样孔以去除气泡。2电泳①取各个处理组蛋白提取液，调整蛋白浓度为6μg/μL，和等体积2上样缓冲液混合，即为上样液。②将上样液于100℃沸水中煮沸5min，使蛋白变性，冰上骤冷，3000转/min离心1min。③每孔加上样液15μL，留一孔加10μL预染的Marker。加满电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，先用80v恒压电泳，约20min，当指示剂溴酚蓝进入分离胶后改用110v恒压电泳，当指示剂到达距凝胶下端约处时关闭电源，取出胶板。3转印蛋白及免疫检测①在电泳即将结束前，预先将PVDF膜浸泡在甲醇中15s，然后用ddH2O漂洗2min，浸泡于转移缓冲液中5min后开始后续操作。②在水中撬胶，修胶后将胶浸泡于转移缓冲液中平衡15min。③按黑面（负极）→海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→海绵→红面（正极）的顺序制备转膜“三明治”。陕西流式抗体第三方检测机构

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