重庆bi 细胞冻存液比例注意事项

细胞复苏佩戴眼镜和手套，从液氮中取出冻存的细胞管。迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌条件下取出细胞。1200rpm/min离心5-10min，弃去上清，加入适量培养液混匀后接种于培养瓶中，次日更换一次培养液。

细胞冻存和复苏操作步骤：

细胞冻存和复苏采取“慢冻快融”的原则，慢速冷冻可使细胞内的水份渗出细胞外，减少细胞内形成冰晶的机会，快融以保证细胞外结晶快速融化，避免慢速融化水份渗入细胞内，再次形成胞内冰晶造成对细胞的损伤。 加入适量的细胞冻存液，重悬细胞，使细胞浓度达到1～10×106/ml，置于冻存管中密闭。重庆bi 细胞冻存液比例注意事项

细胞冻存常用冻存液的成分如下：

20％血清（FBS）、10％DMSO、70％1640培养液；或90％血清（FBS）、10％DMSO，更可防止细胞内冰晶形成。将DMSO和FBS加入DMEM中，各自含量占总体积的10%，然后滤膜过滤后分装保存备用。

注意事项：

1.DMSO 不用高压灭菌;DMEM不能高温高压灭菌，可以过滤除菌。

2.DMSO要用新的 ,而且要避光保存。

3.DMSO:含10%FBS的DMEM=1:9(体积比)。

DMSO在冻存液中的作用： DMSO在4℃时对细胞无明显毒性，分子量小、溶解度大、易透过细胞膜，降低细胞外未结冰溶液中溶质浓度，使细胞免受高浓度溶质的损伤,细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩；DMSO与水分子结合，可使冰点下降，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶损伤。 广州无血清细胞冻存液用血清和培养基的区别细胞冻存液在细胞建株和建系中，及时冻存原始细胞是十分重要的。

细胞复苏

1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

3. 离心， 1000rpm，5min；

4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

5. 次日更换一次培养液，继续培养。注意事项1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但比较好为对数生长期细胞。在冻存前***比较好换一次培养液；

2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免***；

3．冻存和复苏比较好用新配制的培养液。

细胞冻存1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2.取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。3.去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；4.离心1000rpm，5min；5.去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的**终密度为5×106/ml～1×107/ml；6.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；7.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；8.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。细胞冻存液的原理及配制方法?

冻存风险 在冻存中，会对生物材料造成损伤的阶段往往出现在材料结冰的过程中，那么伴随着这样一个结冰的过程，往往会产生以下的风险。

1. 溶液的影响

当冰晶在冻结的水中形成的时候，溶液中的溶质便会析出，液体中会形成很高的溶解物浓度，从而会导致生物材料所处的环境的渗透压升高，对生物材料造成不可逆的损伤。

2. 细胞外的冰晶形成

当生物材料的冻存时间过长时，生物液（水）会从生物材料中迁移出来，并在细胞外形成冰晶，而这样的冰晶对脆弱的细胞膜来说无疑是“致命威胁”。 细胞冻存可以直接放液氮可以吗?上海买细胞冻存液怎么样

细胞冻存的方法与步骤?重庆bi 细胞冻存液比例注意事项

冷冻细胞活化  1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。  2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。  3、材料  37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器 4、步骤：  （1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。  （2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 （3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。 重庆bi 细胞冻存液比例注意事项

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