国内双光子显微镜原理

王爱民副教授结合工作实例，展示了双光子显微镜的研发与应用。历经3年多的协同奋战，成功研制新一代高速分辨微型化双光子荧光显微镜，重量只为2.2克，这一微型显微镜获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像，该显微镜适于佩戴在小动物头部，可实时记录数十个神经元、上千个神经突触的动态信号，在大型动物上，还可望实现多探头佩戴、多颅窗不同脑区的长时程观测。双光子显微成像的在生物医学研究和医疗领域应用有较大的应用前景，首先双光子显微镜能够进行细胞和组织结构成像，在亚微米级成像，此功能与目前市场上的共聚焦类显微镜性能类似；双光子显微成像能够实时、在体、原位、无创地，根据不同物质组份的光谱特性，区分成像；双光子显微镜能够进行生化指标成像，在无造影剂的前提下，利用自发荧光、二次谐波、荧光获得活细胞生化信息。由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源，适用于长时间的研究。国内双光子显微镜原理

配合双光子激发技术，激光共聚扫描显微镜则能更好得发挥功效。那么，什么是双光子激发技术呢？在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子使电子跃迁到较高能级，经过一个很短的时间后，电子再跃迁回低能级同时放出一个波长为长波长一半的光子（P=h/λ）。利用这个原理，便诞生了双光子激发技术。双光子显微镜使用长波长脉冲激光，通过物镜汇聚，由于双光子激发需要很高的光子密度，而物镜焦点处的光子密度是比较高的，所以只有在焦点处才能发生双光子激发，产生荧光，该点产生的荧光再穿过物镜，被光探头接收，从而达到逐点扫描的效果。美国2PPLUS双光子显微镜供应商双光子显微镜只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被发动，所以双光子成像更清晰。

首先我们来简单介绍一下激光扫描共聚焦和双光子这两种当红的显微成像技术。激光扫描共聚焦显微技术，是荧光显微成像的一种，用于激发样品的荧光信号并对其放大成像。在激光扫描共聚焦显微镜中，样品焦平面上每一时刻只有一个点被激发光照射，纵然焦平面外也有激发光照射，但通过探测器前的（pinhole），有焦平面上的荧光信号能被探测器接收。也就是说，每个时刻，只有焦平面上一个点的信号被探测。通过点扫描的方式，一个个点的信号就可以组合出终的图像。双光子显微镜（包括多光子显微镜）同样采用点扫描的方式得到图像。不同的是，其采用的激发光波长较长，只有当两个（或更多）激发光光子几乎同时轰击荧光探针的时候才可能激发出荧光信号。所以只有在光子密度特别大的焦点，出才会激发出荧光。也就是说，双光子显微镜中，同样每个时刻只有焦平面上一个点的信号被探测，并且连焦平面外的荧光信号也不会有。

在国家自然科学基金委国家重大科研仪器研制专项《超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统》的支持下，北京大学分子医学研究所、信息科学技术学院、动态成像中心、生命科学学院、工学院联合中国人民医学科学院组成跨学科团队，历经三年多的协同奋战，成功研制新一代高速分辨微型化双光子荧光显微镜，并获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像。原始论文于5月29日在线发表于自然杂志子刊Nature Methods (IF 25.3)，相关技术文档同步发表于Protocol Exchange (DOI: 10.1038/protex.2017.048)，并已申请多项。双光子显微镜中，同样每个时刻只有焦平面上一个点的信号被探测，并且连焦平面外的荧光信号也不会有。

2008年钱永健等人由于荧光蛋白（GFP，绿色荧光蛋白）的发现和使用，获得了诺贝尔化学奖，是对荧光成像技术的一次巨大肯定和推动。光学成像本身具有高分辨率、高通量、非侵入和非毒性等特点，再与荧光蛋白以及荧光染料等标记物在细胞中的定位与表达技术相结合，使得科学家可以特异性的分辨生物体乃至细胞内部不同结构与成分，并且能够在生命体和细胞仍具有活性的状态下（状态）对其功能进行动态观察。这就使得荧光成像技术成为了无可替代的，生物学家现今较为重要的技术手段之一。目前，大多数细胞生物学和生理学研究主要还是在离体培养的细胞体系中研究。然而与细胞生物学研究有所不同的是，大脑的功能研究的整体性和原位性显得更加关键：只研究分离的神经元无法解释神经系统的功能和规律。由于被观测的信号会受到样本组织的散射和吸收，根本无法穿透如此深的组织进行成像。而双光子显微镜（Two-photonMicroscopy，简称TPM）的发明，则为此类研究带来了希望。双光子显微镜特有的非线性光学特性，再加上其工作波长处在红外区域等特点，令其在生物体组织内的穿透深度较大提高，使得双光子显微镜成为神经科学家进行神经成像较理想的工具。双光子显微镜不需要共聚焦，提高了荧光检测效率。激光荧光双光子显微镜荧光寿命计数

双光子显微镜在组织透明化成像中应用。国内双光子显微镜原理

新一代微型化双光子荧光显微镜体积小，重只2.2克，适于佩戴在小动物头部颅窗上，实时记录数十个神经元、上千个神经突触的动态信号。在大型动物上，还可望实现多探头佩戴、多颅窗不同脑区的长时程观测。相比单光子激发，双光子激发具有良好的光学断层、更深的生物组织穿透等优势，其横向分辨率达到0.65μm，成像质量与商品化大型台式双光子荧光显微镜可相媲美，远优于目前领域内主导的、美国脑科学计划重要团队所研发的微型化宽场显微镜。采用双轴对称高速微机电系统转镜扫描技术，成像帧频已达40Hz（256*256像素），同时具备多区域随机扫描和每秒1万线的线扫描能力。此外，采用自主设计可传导920nm飞秒激光的光子晶体光纤，该系统实现了微型双光子显微镜对脑科学领域较广泛应用的指示神经元活动的荧光探针（如GCaMP6）的有效利用。 同时采用柔性光纤束进行荧光信号的接收，解决了动物的活动和行为由于荧光传输光缆拖拽而受到干扰的难题。未来，与光遗传学技术的结合，可望在结构与功能成像的同时，精细地操控神经元和神经回路的活动。国内双光子显微镜原理

滔博生物，2019-05-27正式启动，成立了nVista，nVoke，3D bioplotte，invivo等几大市场布局，应对行业变化，顺应市场趋势发展，在创新中寻求突破，进而提升Inscopix,envisionTEC,rokit,piezosleep,stoeltingco,unipick,neuronexus,scientifica,alphaomega,divescope,invivo的市场竞争力，把握市场机遇，推动仪器仪表产业的进步。是具有一定实力的仪器仪表企业之一，主要提供nVista，nVoke，3D bioplotte，invivo等领域内的产品或服务。随着我们的业务不断扩展，从nVista，nVoke，3D bioplotte，invivo等到众多其他领域，已经逐步成长为一个独特，且具有活力与创新的企业。值得一提的是，滔博生物致力于为用户带去更为定向、专业的仪器仪表一体化解决方案，在有效降低用户成本的同时，更能凭借科学的技术让用户极大限度地挖掘Inscopix,envisionTEC,rokit,piezosleep,stoeltingco,unipick,neuronexus,scientifica,alphaomega,divescope,invivo的应用潜能。