美国高通量全自动膜片钳电生理技术
内面向外膜片(inside-outpatch)高阻封接形成后,在将微管电极轻轻提起,使其与细胞分离,电极端形成密封小泡,在空气中短暂暴露几秒钟后,小泡破裂再回到溶液中就得到“内面向外”膜片。此时膜片两侧的膜电位由固定电位和电压脉冲控制。浴槽电位是地电位,膜电位等于玻管电位的负值。如放大器的电流监视器输出是非反向的,则输出将与膜电流(Im)的负值相等。外面向外膜片(out-sidepatch)高阻封接形成后,继续以负压抽吸,膜片破裂再将玻管慢慢地从细胞表面垂直地提起,断端游离部分自行融合成脂质双层,此时高阻封接仍然存在。而膜外侧面接触浴槽液。这种膜片形式应测膜片电阻,并消除漏电流和电容电流。整个过程要当心是否形成囊泡。如果浴槽保持地电位水平,膜电位即与玻管电位相等。如放大器是非反向的,放大器的输出将与Im值相等。由于电极前列与细胞膜的高阻封接,在电极前列笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离。美国高通量全自动膜片钳电生理技术
膜片钳技术原理:膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来(见右图),由于电极前列与细胞膜的高阻封接,在电极前列笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离,因此,此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管,用一个极为敏感的电流监视器(膜片钳放大器)测量此电流强度,就单一离子通道电流膜片钳技术的建立,对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的(或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起,同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起,改变了既往各个分野互不联系、互不渗透,阻碍人们较全认识能力的弊端。这一技术的发现和基因克隆技术并架齐驱,给生命科学研究带来了巨大的前进动力。芬兰单电极膜片钳系统膜片钳技术原理膜片钳技术是用玻璃微电极接触细胞,形成吉欧姆(GΩ)阻抗。
全细胞记录构型(whole-cellrecording) 高阻封接形成后,继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂,电极胞内液直接相通,而与浴槽液绝缘,这种形式称为“全细胞”记录。它既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录,或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。在电压钳条件下记录到的大细胞全细胞电流可达nA级,全细胞钳的串联电阻(玻管和细胞内部之间的电阻)应当补偿。任何流经膜的电流均流经这一电阻,所引起的电压降将使玻管电压不同于细胞内的真正电位。电流愈大,愈需对串联电阻进行补偿。全细胞钳应注意细胞必需合理的小到其电流能被放大器测到的范围(25~50nA)。减少串联电阻的方法是玻管尖要比单通道记录大。
离子通道的近代观念源于Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪30—50年代的开创性研究。在1902年,Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上,提出了“膜学说”。他认为在静息状态下,细胞膜只对钾离子具有通透性;而当细胞兴奋的瞬间,膜的破裂使其丧失了选择通透性,所有的离子都可以自由通过。Cole等人在1939年进行的高频交变电流测量实验表明,当动作电位被触发时,虽然细胞的膜电导大为增加,但膜电容却只略有下降,这个事实表明膜学说所宣称的膜破裂的观点是不可靠的。1949年Cole在玻璃微电极技术的基础上发明了电压钳位(voltage clamp technique)技术现代膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。
细胞是动物和人体的基本组成单元,细胞与细胞内的通信,是依靠其膜上的离子通道进行的,离子和离子通道是细胞兴奋的基础,亦即产生生物电信号的基础,生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。由此形成了一门细胞学科———电生理学(electrophysiology),即是用电生理的方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。早期的研究多使用双电极电压钳技术作细胞内电活动的记录。现代膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。通过膜片钳放大器的控制键将微电极的连接电位(junction potentials)调至零位。德国多通道膜片钳离子电流
封接是膜片钳记录的关键步骤之一。美国高通量全自动膜片钳电生理技术
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