全基因组病毒二代测序分析技术

病毒基因组测序：病毒基因组测序包括完成图测序、扫描图测序和重测序三个层面，通过二代/三代测序平台，获得病毒的基因组的序列信息，并在结构基因组学、比较基因组学层面通过差异分析、同源基因分析、共线性分析、物种进化分析等手段探究病毒的毒力系统、基因组的进化与演变历程等。对疑似传染标本采集提取后直接进行高通量测序，通过病原微生物专门用的数据库比对和智能化算法分析，获得疑似致病微生物种属信息，并提供全方面深入的报告，为疑难危重传染提供快速准确诊断依据，促进药物的合理应用。探普生物病毒测序具备反馈处理迅速的优点。全基因组病毒二代测序分析技术

人类的病毒性传染很普遍，病毒可以通过呼吸道、消化道、皮肤等多种途径进行传播，常常会导致严重的公共健康问题，对人类的健康造成威胁。传统的病毒检测方法主要依赖于细胞培养法、抗原抗体结合法等，这些方法耗时久，灵敏度低，往往不能够满足临床检测需求。随着分子生物学的发展，PCR方法用于病毒检测的案例越来越多，但该方法的特异性限制了其同时检测其它病毒的能力。因此，需要通过新的技术来实现。随着二代测序技术成本的降低与普及，二代测序在临床病原体检测方面的优势也越加突显。该技术基于二代测序平台，可以直接从样本中获得病原体的核酸序列信息，再通过生物信息学的方法对得到的序列进行分析，可以快速地对样本中可能存在的全部病原体进行鉴定，缩短了临床检测的周期。全基因组病毒二代测序分析技术想要通过高通量测序获得病毒全序列，需要经历:核酸纯化-文库构建-生物信息学分析这三大基本流程。

第二代测序技术的发展：第二代测序技术(nextgene-rationsequencing,NGS)发展迅猛，与Sanger测序技术相比,NGS是一种能一次对几十万到几百万的DNA分子进行序列测定的高通量的测序技术,这种高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌地分析成为可能,因此又被称为深度测序(deepsequencing).相比传统的个体基因组测序,NGS使得测序价格日益廉价,并且在生物信息学软件的辅助下,可以将大量不同基因片段的信息连接起来进行基因组组装,完成生物的基因组测序，这种新的测序技术革新了植物病毒的诊断方法,对于病毒的流行病学和生态学研究起到了非常重要的推动作用。

病毒全基因组测序定中为了便于新发或罕见病毒性传染病的筛查检测,利用多重置换扩增技术,以负链RNA病毒—发热伴血小板减少综合征病毒和正链RNA病毒—登革病毒为模拟样本探索临床样本中RNA病毒基因组非特异性扩增方法。研究中通过梯度稀释的RNA病毒模拟样本中可能存在的不同丰度的病原体,样本核酸依次加工成单链cDNA,双链cDNA,T4DNA连接酶处理后的双链cDNA以及添加外源辅助RNA后合成并连接的双链cDNA形式,然后进行Phi29DNA聚合酶等温扩增,使用荧光定量PCR方法比较各种方法对RNA病毒核酸扩增的影响。

病毒全基因组进行测序在辅助流调溯源、快速确定传播关系起到了非常关键的作用。

全基因组测序要注意的事项：全基因组测序是对未知基因组序列的物种进行个体的基因组测序。技术路线：提取基因组DNA，然后随机打断，电泳回收所需长度的DNA的片段（0.2~5Kb），加上接头,进行DNA簇（Cluster）制备，后利用Paired-End（Solexa）或者Mate-Pair（SOLiD）的方法对插入片段进行测序。然后对测得的序列组装成Contig，通过Paired-End的距离可进一步组装成Scaffold，进而可组装成染色体等。组装效果与测序深度与覆盖度、测序质量等有关。常用的组装有：SOAPdenovo、Trimity、Abyss等。测序深度（Sequencingdepth）是指测序得到的碱基总量（bp）与基因组大小的比值，它是评价测序量的指标之一。测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。测序的个体，如果采用的是双末端或Mate-Pair方案，当测序深度在50X~100X以上时，基因组覆盖度和测序错误率控制均得以保证，后续序列组装成染色体才能变得更容易与准确。

病毒全基因组测序具有的特点：独有的一定定量技术，实现病原定量分析.RNA病毒全基因组二代测序要多久

二代测序单次运行可以获得海量的数据量，因此也称为高通量测序。全基因组病毒二代测序分析技术

能实现对病毒的全基因组进行测序的技术手段：早期在高通量测序技术普及之前，对病毒的全基因组进行测序是通过非特异性扩增+克隆结合sanger测序来完成的。当物种有了参考的序列之后，可以通过特异性扩增+sanger测序获得全基因组序列。Sanger测序准确度高，读长很长，但与此同时，扩增和克隆工作费时费力，由于流程繁琐，加上快速变异导致引物无法通用，该方法对于大量基因组的测序工作而言，可操作性不强，这对于研究者一直是一个困扰。高通量测序技术正式启用之后，研究者可以将样品处理至标准浓度和体积后进行测序和分析，减少了工作量，增加了成功率。探普生物进行了大量有针对性的研发和测试，开发了全套的实验和分析流程用于对病毒的全基因组进行测序，该流程自运行以来广受研究者们好评。

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