华南地区小巧qPCR仪设置

PCR反应需要五种关键试剂：PCR模板：也称为模板DNA，需要常规的试剂盒进行提取。如基因组DNA（gDNA），cDNA和质粒DNA。DNA聚合酶：所有PCR反应都需要可在高温下工作的DNA聚合酶。Taq聚合酶是一种常用的酶，它可以在70°C时以60个碱基/秒的速率整合核苷酸，并可以扩增高达5kb的模板，使其适用于无特殊要求的标准PCR。引物：DNA聚合酶需要短序列的核苷酸，以指示它们需要在哪里开始扩增。在PCR中，这些序列称为引物，是单链DNA的短片段（约15-30个碱基）。脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs）：是合成DNA新链的基础，包括四个基本DNA核苷酸（dATP，dCTP，dGTP和dTTP）。PCR缓冲液：PCR缓冲液可确保在整个PCR反应过程中保持比较好条件。PCR缓冲液的主要成分包括氯化镁（MGCl2，充当DNA聚合酶的辅助因子），tris-HCl和氯化钾（在反应过程中保持稳定的pH值）。目前市面上已经有很多成熟的包含PCR缓冲液的Taq聚合酶。由于qPCR的高灵敏性，阴性对照有出现扩增信号的情况，那么在针对这类问题时，我们需要判断其原因所在。华南地区小巧qPCR仪设置

PCR：Polymerase chain reaction. 是体外模拟生物的DNA 复制。需要DNA 聚合酶，DNA 模板，两端引物，脱氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及适当的缓冲体系。PCR 产物的增长形式为２N (如果各种试剂和外部所加条件均理想化，N 是循环数)。实际中，扩增效率不为100％。Real time PCR 是定量PCR 的一种，当然是在PCR 的基础上发展出来的。（普通）PCR 包含很多因素，属性，如：试剂，温度，循环数，程序，PCR 产物（扩增子，amplicon）的量，扩增曲线（扩增子累积曲线），掺错率，扩增子长度。一般来说，人们关心的是扩增子的量。而real time PCR 主要利用的是扩增曲线（amplification curve）, 循环数；扩增子长度，扩增效率，扩增子多少，也加以考虑。华南地区小巧qPCR仪设置利用SYBR Green I可以检测PCR反应中获得的全部双链DNA,但是不能区分不同的双链DNA。

了解了荧光阈值的概念后，Ct 值就很好理解了。C Cycle，t threshold，所谓 Ct 值就是在荧光 PCR 扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。如上文中图所示，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超过黑色线时所经历的循环数即为 Ct 值。从这也可以了解到 Ct 值是可以变化的，我们实验时带有一定的人为因素。而荧光定量 PCR 后面的数据处理要用到 Ct 值来计算，所以有关荧光阈值的设置就显得尤为重要。一般说来，新手按荧光 PCR仪的自动设置为好，而如果你非常有经验，一般会手动设置荧光阈值。因为 Ct值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少， Ct 值也就越小，反之亦然。正常的 CT值范围在 18-30 之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。前面也提到过，同一模板经过 96 次 PCR 扩增，扩增产物虽然不恒定，但Ct 值极具重现性。根据这个特点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的。Ct 值做出标准曲线，只要在同一次 PCR 实验中得到未知样品的 Ct 值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。

RT-PCR是利用逆转录酶通过随机引物或Oligo（dT），或者特异性下游引物将mRNA反转成cDNA，再以cDNA作为PCR的模板进行后续反应。现今已有一些商用的一步法RT-PCR试剂盒，相比于普通PCR，其检测步骤在变性前增加了约30分钟（50℃）的逆转录过程，不需要单独进行逆转录过程，操作更为简单。qPCR是在普通PCR基础上，利用荧光标记和光学检测技术对其的改进，是对核酸定性和定量检测的技术，也是现今主流的核酸检测断技术之一，并且常作为金标准方法与研发的新方法相比较。qPCR在原有PCR基础上与荧光检测方法结合，实现了PCR从定性到定量的飞跃，具有灵敏度高、特异性强的优点，还有效规避了普通PCR污染环境和检测结果容易出现假阳性的弊端。qPCR通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

PCR 反应中通过控制温度变化使得核酸分子重复地解链与延伸，从而实现对目的片段的指数扩增。因此，准确的温度控制与快速的变温系统是实现高效的 qPCR 实验的基础与关键。加热块各处温度越一致，则因位置差异。而带来的样品之间的扩增效率差异越小。q225 系列荧光定量 PCR 仪突破性地采用了复合式液体冷却循环系统，极大的消除了单一风冷散热器所带来的温度均一性差、降温速率慢、仪器噪音大等缺陷，可将96 孔间温度差控制在±0.15°C 以内，确保每一孔内的实验均严格按照您所设置的控温程序进行。qPCR 反应所需时间很大程度上取决于对反应溶液进行变温所需要的时间，而这一过程又受到加热块升降温速度和液体升降温速度两方面的影响。q225 所使用的热循环系统峰值变温速率可达4°C/s，更重要的是，经过精密设计的加热块能够很大程度地贴合孔板形状，实现高效的热传导，使得在加热块达到预定温度后反应溶液也能在短时间内达到相同温度，反应溶液温度更为均一。q225 出色的热循环系统设计使得40 个循环的常规 qPCR 可以在短短43 分钟内轻松完成，让您的工作效率获得质的提升 。qPCR荧光标记法分为SYBR Green I染料法为主的荧光染料嵌合法，以Taqman探针法为主的荧光探针法.上海灵敏度qPCR仪材质

为了进一步确保荧光检测的就是靶DNA序列，人们又设计了只能与目的DNA序列特异结合的荧光探针如TaqMan探针。华南地区小巧qPCR仪设置

内标在传统定量中的作用：由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．内标对定量PCR的影响：若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为***。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。华南地区小巧qPCR仪设置

广州双螺旋科学仪器有限公司致力于精细化学品，是一家服务型的公司。双螺旋科学仪器致力于为客户提供良好的数字PCR，纯水机，病理切片机，倍性分析仪，一切以用户需求为中心，深受广大客户的欢迎。公司从事精细化学品多年，有着创新的设计、强大的技术，还有一批专业化的队伍，确保为客户提供良好的产品及服务。双螺旋科学仪器立足于全国市场，依托强大的研发实力，融合前沿的技术理念，及时响应客户的需求。