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实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。3.分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。实时荧光定量PCR技术有效解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度。广州Quantagene q225mxqPCR仪报价

qPCR和dPCR:研究人员已经通过两种方式克服了定量PCR分析的挑战：实时定量PCR(qPCR)和数字PCR(dPCR)。qPCR主要使用插入染料或荧光探针(例如TaqMan)。通过监测PCR期间的荧光强度，可以比较多个样品的DNA水平。数字PCR(dPCR)的基本工作原理很简单。先将样品分为多个PCR反应，每个反应多包含一个模板。然后通过对阳性和阴性反应进行计数来确定初始样品中模板分子的数量。尽管qPCR和dPCR都能够定量样品中的核酸，但它们有一个重要的区别。qPCR只能实现相对定量(例如，样品A的目标序列是样品B的目标序列的两倍)，除非使用此标准生成标准曲线。数字PCR本身是定量的，不需要标准曲线。另一方面，qPCR技术更加成熟和众所周知，市场上有大量商业产品可供选择。dPCR仍然是小的新鲜肉。它不如qPCR使用且价格昂贵。与dPCR相比，qPCR更适合于高通量分析，并且动态范围广。华南地区节省qPCR仪价格Taqman探针法因特异性高，被广泛应用于等位基因鉴别、SNP分型、病原体和病毒检测、多重定量等。

SYBR Green I染料法实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接透过管盖，激发荧光探针。荧光探针事先混合在PCR反应液中,只有与DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成目的DN段的增加,结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光也相应增加。简单的DNA结合的荧光探针是非序列特异性的，以非饱和染料中常用的SYBR GreenI染料为例，这种荧光染料激发光波长520 nm,只能与双链DNA结合，与DNA双链结合时,荧光强度出现明显增大的非特异性染料。每形成一条DNA双链，就有相应数量的SYBR Green I染料嵌入并产生荧光，因此荧光信号强度变化与PCR产物浓度变化呈正相关，原理如图2所示。耀海在进行质粒拷贝数测定时采用qPCR染料法，即大肠杆菌克隆表达得到的质粒DNA，其菌种质粒拷贝数的测定采用荧光定量PCR法。以质粒中卡那霉素抗性基因序列为靶标基因设计扩增引物，建立基于SYBR的qPCR检测方法，用于某大肠杆菌菌种中质粒拷贝数的检测。

使用 PCR 扩增 DNA 是当今实验室的一项基础技术，创新不断将其应用范围从研究实验室扩展到临床。定量 PCR (qPCR) 允许对靶 DNA 进行相对定量，并且是一种可靠的、已建立的测试特定序列是否存在的方法（例如，大多数基于 PCR 的冠状病毒测试使用 qPCR）。另一种 PCR 形式，数字PCR (dPCR) 或液滴数字 PCR (ddPCR)，使用类似的化学方法检测 DNA 序列，但在许多微小体积或液滴中进行检测，利用数学的力量提高信噪比。qPCR和 dPCR 有很多相似之处和不同之处，但在与 PCR **交谈时，有几个重要的品质更加突出。尽管 dPCR 可能在灵敏度方面表现出色，但 qPCR 仍然是许多其他应用的比较好选择。“我们建议我们的客户在基因表达中使用 qPCR，因为它的动态范围很广；其量化不同表达水平、区分剪接变体和多重分析的能力；及其高通量应用和自动化的能力，”Alsarraj 说。事实上，它在实验室和监管环境中更为人所知，并用于基因、健康状况或传染病的筛查。SYBR Green I 是一种结合于所有双链DNA（dsDNA）双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。

qpcr的检测原理：qPCR主要是使用插入染料或荧光探针(例如TaqMan)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程，然后通过标准曲线来对未知模板进行定量分析。qPCR 主要是依赖于标准品制备标准曲线，进而去确定未知样品的浓度，因此是一种相对定量的方法。随着PCR的循环进行，染料荧光强度增加，从而检测到定量反应的DNA。SYBR Green是一种DNA插入染料，范围广用于qPCR。虽然SYBR Green方法比探针方法便宜，但是特异性没有荧光探针方法好。Quantagene q225系列qPCR 43分钟完成实验，加3分钟做完熔解曲线只需43分钟即可完成40循环的常规qpcr实验。广州Quantagene q225mxqPCR仪应用

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