广西互作蛋白检测CoIP Western Blot检测

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到富集的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。CoIP实验内源检测与外源检测的优缺点。广西互作蛋白检测CoIP Western Blot检测

IP-WB（免疫沉淀-Western Blot）实验要点主要包括以下几个步骤：样品制备：确保样品新鲜且未经过多次冻融，以避免蛋白降解。裂解细胞或组织，获得含有目标蛋白及其相互作用伙伴的裂解液。免疫沉淀：选择特异性强的抗体，与目标蛋白结合形成复合物。将复合物与固相载体（如磁珠）结合，通过洗涤去除非特异性结合的杂质。电泳分离：将免疫沉淀得到的蛋白质复合物进行SDS-PAGE凝胶电泳，按照分子量大小分离蛋白质。Western Blot检测：将电泳后的蛋白质转移到固相膜上，利用特异性抗体检测目标蛋白或其相互作用伙伴的存在。通过显色反应可视化目标蛋白，确保特异性结合。结果分析：观察Western Blot结果，分析目标蛋白与其相互作用伙伴的相互作用情况，为后续研究提供依据。河南免疫共沉淀检测CoIP-mass spectrometry检测免疫共沉淀实验的注意事项主要包括几点。

免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。

免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）：利用抗原抗体特异性反应，对某个特定蛋白纯化富集的方法，主要过程包括捕获和固定。(2)免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）：CoIP是在IP实验的基础上进行的扩展，主要用于蛋白之间的互作研究，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中已知或未知的蛋白组分。其原理是基于抗体与抗原（靶蛋白）之间的特异性结合，此时如果样品溶液中存在能与靶蛋白相互作用的目的蛋白，会一同被拉下来，随后利用SDS-PAGE，WesternBlot等方法对得到的目标蛋白进行分析，进而证明两者间的相互作用。

CoIP-Mass和CoIP-WB检测要点：

抗体关键质控：抗体特异性和亲和效价要求高，尽量采用标签抗体或经过CoIP效果验证的抗体。抗体质量参差不齐（WB能检测到预期条带不到1/2，能检测到良好结果的不到1/4）和存在非特异性结合（几乎所有的抗体都存在非特异结合，部分非特异结合条带远大于目的条带），CoIP-MS需做WB和CoIP-WB质控。初次和检测CoIP都需要做WB质控。正式CoIP可同时增加考染/银染质控。抗体可参考数据库（ValidatedAntibodyDB,)。 Co-IP技术可靠但需注意潜在限制，选特异性抗体、控制条件，多方法验证提升准确性！

免疫共沉淀实验步骤主要包括以下五个部分：样品处理：将细胞或组织样品进行裂解，得到待检测的蛋白质混合物，并加入蛋白酶抑制剂以避免目标蛋白被降解。抗体处理：将专一的抗体连接到亲和树脂上，如蛋白A的亲和树脂或蛋白G的亲和树脂，或将蛋白与其特异性抗体结合，新形成的复合物与封闭剂缓慢摇摆在二氧化硅珠上，使碘酸钙交联后节制反应。免疫共沉淀：将有抗体树脂的样品与吸附抗体树脂形成免疫复合物。洗涤：采用洗涤缓冲液对样品进行洗涤，以去除非特异性的蛋白质和杂质，同时尽量避免对复合物的影响。洗涤缓冲液选择对样品不会引起较大影响的缓冲液和洗涤剂。蛋白鉴定：将沉淀的复合物通过SDS-PAGE分离出来，并进行Western blotting检测目标蛋白及其配偶蛋白。另一方面，也可以直接使用质谱分析检测。入门Co-IP实验，需理解原理、选对抗体、处理样本、严控操作，安全细心，不断积累经验！陕西蛋白蛋白互作检测CoIP WB检测

IP-Mass（免疫沉淀-质谱）技术应用场景。广西互作蛋白检测CoIP Western Blot检测

CoIP实验免疫沉淀方法如下：

将25µL(0.25mg)的Pierce蛋白A/G的磁珠加入1.5mL离心管中。

向磁珠中加入175µL免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液，轻微涡旋混匀。

将离心管放入磁力架中收集磁珠到离心管的一边。去除上清。

向离心管中加入1mL免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液。颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1min。用磁力架收集磁珠。去除上清。

将抗原样品/抗体混合物加入盛有磁珠的离心管中，保持混匀室温下孵育1h。

用磁力架收集磁珠，除去未结合的样品，保存以备分析。

向离心管中加入500µL免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液，轻柔混匀。收集磁珠，弃上清。再重复洗两次。

向管中加入500µL超纯水，轻柔混匀。用磁力架收集磁珠，弃上清。

低pH洗脱：向离心管中加入100µL洗脱液。保持混匀在室温下孵育离心管10min。通过磁力分离磁珠，保留含有目的抗原的上清。每100µL洗出液中加入10µL中和液来中和低pH。备选洗脱方法：向离心管中加入100µL1X电泳上样缓冲液，将样品置于加热器中，96-100℃加热10min。通过磁力架分离磁珠，保留含有目的抗原的上清。

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